Choroby nowotworowe są - obok schorzeń układu krążenia - najczęstszą przyczyną zgonów, dlatego w laboratoriach światowych trwa swoista pogoń w poszukiwaniu nowych metod ich leczenia oraz diagnozowania. Stosowane obecnie w onkologii klinicznej metody, takie jak radio- czy chemioterapia wykazują istotne ograniczenia, jak na przykład brak selektywnego działania na tkankę nowotworową, co prowadzi w efekcie do licznych powikłań związanych z uszkodzeniem zdrowych tkanek. Dlatego terapia fotodynamiczna - PDT (ang. photodynamic therapy) oparta na wykorzystaniu światłoczułych związków selektywnie kumulujących się w tkance nowotworowej, wydaje się w tym aspekcie bardzo obiecująca.
W metodzie tej (rys.1) w wyniku szeregu reakcji fizykochemicznych, generowanych po aktywacji fotobarwnika (tzw. fotouczulacza) światłem o odpowiedniej długości fali dochodzi do powstania reaktywnych form tlenu i stresu oksydacyjnego, a w rezultacie do śmierci komórki. Najbardziej istotnym wydaje się fakt, że zarówno światło, jak i fotouczulacz zastosowane oddzielnie nie są cytotoksyczne, przynajmniej w dawkach normalnie aktywnych fotodynamicznie. Dopiero ich łączne użycie powoduje martwicę naświetlanej tkanki. Intensywna czerwona fluorescencja skumulowanego w tkance nowotworowej barwnika pozwala ponadto na precyzyjne zlokalizowanie nawet niewielkich zmian nowotworowych, co jest podstawą diagnostyki fotodynamicznej - PDD (ang. photodynamic diagnostic).
Trochę historii
Z uzdrawiającej siły światła ludzkość korzysta już od wieków. W starożytności stosowano światło oraz ekstrakt roślin bogatych w psoralen do leczenia bielactwa nabytego, krzywicy i łuszczycy. Jednak dopiero na przełomie XIX i XX wieku fototerapia została uznana jako nauka. W 1900 roku O. Raab wykazał obumieranie pantofelków naświetlanych światłem ultrafioletowym w obecności barwników akrydynowych. Trzy lata później H. von Tappeiner i A. Jesionek zastosowali eozynę i światło słoneczne do leczenia nowotworów skóry. W 1924 Policard zaobserwował czerwoną fluorescencję endogennych porfiryn w ludzkich guzach po naświetleniu ich światłem ultrafioletowym. W następnych latach pojawiało się coraz więcej doniesień o powodzeniach w diagnozowaniu i leczeniu chorób nowotworowych przy pomocy światła oraz fotouczulacza. Gwałtowny rozwój terapii fotodynamicznej nastąpił w latach osiemdziesiątych. Metodę tę zaczęto wykorzystywać do leczenia nowotworów płuc, głowy, szyi, pęcherza moczowego, jak również w przypadku chorób nienowotworowych (angioplastyka naczyń krwionośnych, grzybice, łuszczyca). W Polsce pierwsze badania nad wykorzystaniem porfiryn w terapii i diagnostyce nowotworowej rozpoczęto w 1984 roku w Pracowni Chemii Instytutu Optoelektroniki Wojskowej Akademii Technicznej w Warszawie.
Do końca 1994 roku w Pracowni Chemii Instytutu Optoelektroniki WAT w zespole kierowanym przez prof. Alfredę Graczyk opracowano nową klasę fotouczulaczy rozpuszczalnych w wodzie, a będących diaminokwasowymi pochodnymi protoporfiryny. Związki te wykazały dużą efektywność w wykrywaniu i leczeniu wielu typów nowotworów.
Obecnie fotodynamiczna diagnostyka i terapia stosowana jest również w kilku innych ośrodkach, m.in. w Ośrodku Diagnostyki i Terapii Laserowej III Katedry i Kliniki Chorób Wewnętrznych w Bytomiu, kierowanym przez prof. Aleksandra Sieronia.
Skuteczność PDT, jak i PDD zależy głównie od właściwości stosowanego fotouczulacza. Dlatego w ostatnich latach wiele uwagi poświęca się syntezie i określeniu parametrów fizykochemicznych nowych typów związków fotoaktywnych.
Charakterystyka spektralna fotouczulaczy
W nieobecności substancji wygaszających w układzie, fotofizyczne procesy zachodzące w molekule wygodnie jest przedstawić na diagramie poziomów energetycznych Jabłońskiego, który stanowi uproszczony układ kilku najniższych stanów elektronowych w jakich może znajdować się molekuła (rys.2). W przypadku form pierścieniowych cząsteczek organicznych elektronowa energia wzbudzenia ze stanu podstawowego (S0) do pierwszego wzbudzonego stanu singletowego (S1) odpowiada długościom fal z zakresu nadfioletowego i widzialnego (300-800 nm). Zaabsorbowana przez cząsteczkę energia może być następnie wyemitowana w postaci szeregu procesów fizykochemicznych, które ze sobą współzawodniczą. Nadmiar energii cząsteczki wzbudzonej może być np. wyemitowany w postaci luminescencji, zamieniony na ciepło, przekazany do innej cząsteczki lub zużyty na reakcje fotochemiczne. Z punktu widzenia terapii fotodynamicznej najbardziej istotne są dwie drogi powrotu molekuły do podstawowego stanu elektronowego. A mianowicie cząsteczka może powrócić na drodze promienistej do jednego z poziomów oscylacyjnych podstawowego stanu elektronowego (S0). Proces ten wykorzystywany jest w diagnostyce fotodynamicznej, gdyż czerwona fluorescencja fotobarwnika pozwala na precyzyjne określenie położenia zmiany nowotworowej lub na drodze bezpromienistej w wyniku przejścia interkombinacyjnego do metatrwałego stanu trypletowego (T1). Czas życia cząsteczki fotouczulacza w stanie trypletowym jest wystarczająco długi, by mogła ona wziąć udział w reakcjach chemicznych prowadzących do przekazania nadmiaru energii sąsiednim cząsteczkom, np. cząsteczce tlenu molekularnego.
W wyniku bezpośredniego działania produktów reakcji fotodynamicznych na organelle subkomórkowe śmierć komórki odbywa się na drodze nekrozy lub apoptozy. Produkty reakcji mogą również uszkadzać system naczyniowy nowotworu (śródbłonek i inne komponenty ścian naczyń), co w konsekwencji prowadzi do hipoksji i niedoboru substancji odżywczych, a w efekcie powoduje śmierć komórki nowotworowej.
Poszukiwania odpowiedniego fotouczulacza to wyzwanie dla chemików i fizyków. Z punktu widzenia spektroskopii UV-VIS istotnym wydaje się pasmo absorpcji fotobarwnika. Najbardziej wydajne są fotouczulacze, których pasma absorpcji przesunięte są w stronę fal dłuższych (ok. 720 nm), bowiem to właśnie światło czerwone najgłębiej penetruje tkankę. Z innych istotnych właściwości fotouczulacza, decydujących o jego efektywności fotodynamicznej wymienić należy: czas życia we wzbudzonym stanie trypletowym, wydajność kwantową stanu trypletowego a także kwantową wydajność tlenu singletowego. Czynniki te stanową bowiem gwarancję wysokiej fototoksyczności dla komórek nowotworowych.
Dlaczego porfiryny?
W świetle powyższych kryteriów, to właśnie porfiryny spełniają większość wymagań stawianych obecnie fotouczulaczom:
Najbardziej rozpowszechnionym fotouczulaczem tej grupy jest Photofrin, który jest pierwszym związkiem zatwierdzonym przez FDA i obecnie stosowanym w praktyce klinicznej. Ze względu na niejednorodny skład i ograniczone własności fotoaktywności niektórych komponentów wchodzących w jego skład, wykazuje ograniczone działanie.
Geometria pierścienia porfirynowego
Porfiryny należą do grupy makrocyklicznych związków aromatycznych, które zawierają układ 18 elektronów zdelokalizowanych w obrębie płaskiego pierścienia. Zasadniczym elementem ich budowy chemicznej jest pierścień porfirynowy zbudowany z czterech cząsteczek pirolu połączonych mostkami metinowymi (rys.3). Centrum reakcyjne cząsteczki porfiryny składa się z czterech atomów azotu i dwóch atomów wodoru. Pierścień porfirynowy może podlegać wielu modyfikacjom. I tak podstawienie atomu żelaza w centrum pierścienia pozwala otrzymać cząsteczkę hemu, który odpowiedzialny jest za transport tlenu w krwioobiegu organizmów żywych. Z kolei podstawienie tego miejsca innym metalem - magnezem, daje dobrze znany z procesów fotosyntezy chlorofil. Duża ilość centrów reakcji w pierścieniu porfirynowym oraz różnorodność możliwych podstawników bocznych pozwala na otrzymanie wielu pochodnych o właściwościach hydrofobowych, hydrofilowych oraz amfifilowych.
Poniżej przedstawiono najczęściej wykorzystywane w terapii i diagnostyce fotodynamicznej fotouczulacze:
Nasz wkład w badania syntetycznych pochodnych porfiryn
Od kilku lat poszukujemy substancji fotouczulających o potencjalnym zastosowaniu w terapii fotodynamicznej. Zespół chemików podjął się zadania otrzymywania syntetycznych pochodnych porfiryny o wymaganych właściwościach spektroskopowych. Otrzymane przez nich pochodne podstawiane były grupami aminokwasowymi, cholesterylowymi, rybozowymi itp. Struktury chemiczne przykładowych związków 5-(4-hexadecyloksyfenylo)-10,15,20-tri-pirydyloporfiryny (TPYR-TPP) oraz 10,15,20-tritoliloporfiryno 5(4’amido-fenylocarbobenzy-loksyglicyny) (GP) przedstawiono na rys.4.
Z kolei grupa fizyków rozpoczęła badania pozwalające określić właściwości fizykochemiczne takie jak: strukturę krystaliczną, strukturę elektronową (spektroskopia UV-VIS, IR, XPS) czy kwantową wydajność tlenu singletowego.
Dopiero bowiem pełna charakterystyka fizykochemiczna uzyskanych syntetycznych pochodnych porfiryny pozwala na wybór ich do dalszych badań biologicznych i określenie ich ewentualnej przydatności w metodzie fotodynamicznej.
W tabeli 1 podane zostały wartości kwantowej wydajności tlenu singletowego oraz czasy jego życia wyznaczone z bezpośrednich pomiarów emisji jego fosforescencji.
Uzyskane wartości dla badanych fotouczulaczy oscylują wokół wartości 0.6 i są prawie dwa razy większe od wartości otrzymanej dla Photofrinu, handlowego preparatu dopuszczonego w 1999 roku przez FDA do stosowania klinicznego. Zaskakująco wysoką wydajność tlenu singletowego, bo 0.8 otrzymano dla pochodnej TPYR-PP, która okazała się także najefektywniejszym fotouczulaczem w badaniach biologicznych in vitro. Również pozostałe parametry fizykochemiczne charakteryzujące badane związki pod kątem ich zastosowań w PDD i PDT pozwoliły stwierdzić, iż spełniają one wszelkie wymagane kryteria.
Dla chemików i fizyków stało się oczywistym, że otrzymali i scharakteryzowali nowe pochodne porfiryny, które mogłyby być zastosowane jako fotouczulacze w metodzie fotodynamicznej. Aby potwierdzić te przypuszczenia podjęte zostały badania biologiczne na liniach komórkowych in vitro. Badania te wykonano w Centrum Onkologii w Gliwicach.
Badania biologiczne
W oparciu o charakterystykę fizykochemiczną badanych związków w pierwszym etapie doświadczeń in vitro przeprowadzono testy cytotoksyczności. Celem tych doświadczeń było wyselekcjonowanie najmniej toksycznego związku o najkorzystniejszych właściwościach fotouczulających. Jako nośnika użyto liposomów kationowych. Badania in vivo dowodzą bowiem, że transport porfiryn za pośrednictwem liposomów zwiększa selektywność akumulacji tych związków w komórkach nowotworowych. Ponadto użycie nośników liposomowych redukuje także cytotoksyczność porfiryn i chroni je przed przedwczesną degradacją, przyczyniając się do zwiększenia efektywności fotouczulacza.
W badanich in vitro wykorzystano kilka linii komórkowych, m.in. komórki czerniaka ludzkiego linii Me45 oraz komórki gruczolakoraka okrężnicy linii Hct-116. Celem doświadczeń była:
Na rys.5 przedstawiono wykres tzw. toksyczności ciemnej (bez dostępu światła) oraz fototoksyczności badanych pochodnych i Photofrinu (PH), jako związku referencyjnego. Zbadano pięć różnych dawek energii. Przeżywalność komórek oceniano testem MTS po 24 godzinach od zakończenia naświetlania. Inkubacja komórek z badanymi fotouczulaczami bez naświetlania nie powodowała znaczącego zahamowania ich wzrostu (dawka energii zero). Zahamowania proliferacji nie obserwowano także w przypadku naświetlania grup kontrolnych. Świadczy to, iż żaden z tych czynników oddzielnie, tak światło jak i fotouczulacz, nie powodują efektu cytotoksycznego. W przypadku inkubacji komórek z badanymi związkami a następnie naświetlania różnymi dawkami energii obserwowano zahamowanie proliferacji w stosunku do kontroli. Tak jak oczekiwano, przeżywalność komórek zależała od dawki stosowanego źródła światła i znacząco malała w miarę jej zwiększania. Interesujący wydaje się fakt, że z porównania efektywności przedstawionych tutaj związków wynika, iż obie pochodne wykazują działanie zbliżone do Photofrinu, leku obecnie wykorzystywanego w badaniach klinicznych.
Wewnątrzkomórkowe rozmieszczenie obu pochodnych porfirynowych oceniano przy pomocy mikroskopii konfokalnej (rys.6). Eksperymenty prowadzono na komórkach czerniaka ludzkiego Me45, które wydawały się być stosunkowo oporne na działanie terapii w przypadku badanych związków. Lokalizację fotouczulaczy oceniano po 4 i 12 godzinach od zakończenia inkubacji z fotouczulaczami. W przypadku pochodnej TPYR-PP po 4 godzinach obserwowano akumulację fotouczulacza głównie w błonie plazmatycznej oraz peryferyjnych obszarach cytoplazmy. Po 12 godzinach obserwowano kondensację fotouczulacza głównie w organellach komórkowych w przestrzeni wokół jądra komórkowego. W przypadku GP po 4 godzinach inkubacji związku z komórkami. obserwowano intensywne, rozproszone świecenie w całym obszarze cytoplazmy. W żadnym z przypadków fluorescencja nie była widoczna w jądrze komórkowym, a dokładne określenie lokalizacji fotouczulaczy w obrębie struktur komórkowych wymaga dalszych badań z zastosowaniem odpowiednich dla danych organelli markerów fluorescencyjnych.
Wpływ terapii fotodynamicznej na rodzaj śmierci komórkowej oceniano metodą Lelli opartą na morfologicznym różnicowaniu komórek apoptotycznych i nekrotycznych po wybarwieniu mieszaniną oranżu akrydyny i bromku etydyny OA/BE. Zastosowano dwie dawki energii: 7,5 oraz 15 J/cm2. Analizę przeprowadzano tuż po naświetleniu oraz 3, 6, 12 i 24 godziny po jego zakończeniu.
Apoptoza i nekroza to procesy śmierci komórki wykazujące między sobą zmiany morfologiczne i biochemiczne. Charakterystyczna dla procesu nekrozy jest utrata integralności błony komórkowej, pęcznienie komórki a w efekcie jej liza. W warunkach in vivo śmierci nekrotycznej towarzyszy wyraźna reakcja zapalna. W przypadku śmierci apoptotycznej obserwuje się obkurczenie komórki, kondensację chromatyny oraz pęcherzyki w błonie bez utraty jej integralności. Dla zobrazowania na rys. 7A, B pokazano morfologiczną różnicę pomiędzy komórką apoptotyczną a nekrotyczną, a na rys. 7C przedstawiono morfologiczne zmiany obserwowane po 6 godzinach w komórkach Me45 traktowanych TPYR-PP oraz naświetlanych dawką 15 J/cm2 po wybarwieniu ich OA/BE. Błona komórkowa komórek nieuszkodzonych lub we wczesnym stadium apoptozy jest nieprzepuszczalna dla emitującego pomarańczowo-czerwoną fluorescencję bromku etydyny (BE), zaś jest całkowicie przepuszczalna dla oranżu akrydyny (OA) emitującego fluorescencję zieloną. Z naszych badań wynika, że śmierć nekrotyczna będzie procesem dominującym w terapii fotodynamicznej po zastosowaniu badanych fotouczulaczy.
Wnioski
Zespół badawczy
Zespół badawczy, który realizuje badania nad poszukiwaniem skutecznych w metodzie PDT syntetycznych fotouczulaczy przedstawiono poniżej:
Chemicy Instytut Chemii UŚ |
dr Piotr Kuś dr Jan Habdas |
technologia, oczyszczanie, wstępna analiza chemiczna (chromatografia, NMR) |
Fizycy Instytut Fizyki UŚ |
dr Gabriela Kramer-Marek mgr Agnieszka Szurko dr hab. Roman Wrzalik prof. dr hab. Jacek Szade |
spektroskopia UV-VIS, IR, XRD, XPS |
Biolodzy Centrum Onkologii Gliwice |
dr hab. Maria Wideł dr Aleksander Sochanik lek. med. Mirosław Śnietura |
badania biologiczne in vitro |
Współpraca Uniwersytet w Coimbra, Portugalia |
dr Luis Arnaut dr Carlos Serpa |
badania kwantowej wydajności tlenu singletowego |